Gene expression data analysis using novel methods: Predicting time delayed correlations and evolutionarily conserved functional modules

Microarray technology enables the study of gene expression on a large scale. One of the main challenges has been to devise methods to cluster genes that share similar expression profiles. In gene expression time courses, a particular gene may encode transcription factor and thus controlling several genes downstream; in this case, the gene expression profiles may be staggered, indicating a time-delayed response in transcription of the later genes. The standard clustering algorithms consider gene expression profiles in a global way, thus often ignoring such local time-delayed correlations. We have developed novel methods to capture time-delayed correlations between expression profiles: (1) A method using dynamic programming and (2) CLARITY, an algorithm that uses a local shape based similarity measure to predict time-delayed correlations and local correlations. We used CLARITY on a dataset describing the change in gene expression during the mitotic cell cycle in Saccharomyces cerevisiae. The obtained clusters were significantly enriched with genes that share similar functions, reflecting the fact that genes with a similar function are often co-regulated and thus co-expressed. Time-shifted as well as local correlations could also be predicted using CLARITY. In datasets, where the expression profiles of independent experiments are compared, the standard clustering algorithms often cluster according to all conditions, considering all genes. This increases the background noise and can lead to the missing of genes that change the expression only under particular conditions. We have employed a genetic algorithm based module predictor that is capable to identify group of genes that change their expression only in a subset of conditions. With the aim of supplementing the Ustilago maydis genome annotation, we have used the module prediction algorithm on various independent datasets from Ustilago maydis. The predicted modules were cross-referenced in various Saccharomyces cerevisiae datasets to check its evolutionarily conservation between these two organisms. The key contributions of this thesis are novel methods that explore biological information from DNA microarray data

Transkriptom-Analyse der frühen Infektionsphase von Ustilago maydis: Identifikation neuer pathogenitätsrelevanter Gene

Im phytopathogenen Pilz Ustilago maydis ist die Fusion kompatibler haploider Sporidien für die Initiation der pathogenen Entwicklung notwendig. Kontrolliert wird dieser Prozess durch zwei verschiedene Kreuzungstyploci, a und b. Der biallelische a-Locus kodiert dabei für ein Pheromonrezeptorsystem, welches für die Zell-Zellerkennung und die Fusion notwendig ist. Nach der Fusion ist der multiallelische b-Paarungstyplocus, der für zwei Homeodomänen-Transkriptionsfaktoren kodiert, für die Aufrechterhaltung des filamentösen Dikaryons und die nachfolgende pathogene Entwicklung essentiell. Nach der Bildung eines stabilen Dikaryons ist U. maydis zur Vollendung seiner sexuellen Entwicklung jedoch auf die Wirtspflanze angewiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch DNA-Microarray-Analysen frühe b-vermittelte Prozesse auf der Pflanzenoberfläche untersucht. Hierfür wurde das Expressionsprofil von Zellen eines nicht-pathogenen Stammes mit dem eines pathogenen Stammes, der ein aktives b-Heterodimer exprimiert, verglichen. Es wurden insgesamt 327 Gene identifiziert, die u. a. für Proteine mit putativen Funktionen im Pflanzenzellwandabbau oder bei der Transkriptionsregulation kodieren. Eines der auf der Pflanzenoberfläche b-induzierten Gene, biz1, kodiert für einen putativen C2H2-Zinkfinger-Transkriptionsfaktor. Die Deletion von biz1 führte zu einer drastischen Reduktion der Anzahl an gebildeten Appressorien; Hyphen konnten zwar noch die Pflanzenoberfläche penetrieren, jedoch war invasives Wachstum und in planta Proliferation in Δbiz1-Stämmen nicht zu beobachten. Biz1 spielt demnach nicht nur eine wichtige Rolle in der Bildung von Appressorien, sondern vor allem in der Kolonisierung der Pflanze. Weitere DNA-Microarray-Analysen zeigten, dass Biz1 für die Regulation von 19 Genen on planta hinreichend und notwendig ist. Systematische Deletionsanalysen führten zur Identifizierung von pst1 und pst2, die für zwei putative sekretierte U. maydis-spezifische Proteine kodieren. Die gemeinsame Deletion beider Gene führte zu einem ähnlichen Phänotyp wie die Deletion von biz1. Der pst-Doppeldeletionsstamm war zwar noch in der Lage Appressorien zu bilden, arretierte sein Wachstum aber kurz nach der Penetration und zeigte ebenfalls keine Proliferation in der Pflanze. Pst1 und Pst2 scheinen damit ähnlich wie Biz1 ihre Hauptfunktion in Postpenetrationsprozessen auszuüben

Regulationsmechanismen der biotrophen Entwicklung von Ustilago maydis

Die Koordination komplexer Entwicklungsvorgänge in multizellulären Organismen erfordert eine stringente Regulation und die Verknüpfung verschiedener Signalwege. Bei Hefen und filamentösen Pilzen ist die sexuelle Entwicklung oftmals an spezifische Stadien des Zellzyklus gekoppelt, wodurch die synchrone Entwicklung verschiedener Zellen gesichert und ein geordneter Ablauf der zellulären Differenzierung gewährleistet wird. Bei dem dimorphen Basidiomyzeten U. maydis sind sexuelle und pathogene Entwicklung eng miteinander verknüpft und finden in Abhängigkeit der Wirtspflanze Mais statt. Voraussetzung für die Bildung des filamentösen Dikaryons, der infektiösen Wuchsform von U. maydis, ist die gegenseitige Erkennung und Verschmelzung kompatibler Sporidien, welche durch das Pheromon/Rezeptorsystem des a-Kreuzungstyp-Locus gesteuert wird. Die Aktivierung dieses Systems führt zu einem Zellzyklusarrest in der G2-Phase und der Ausbildung von Konjugationshyphen. Nach der Fusion der Konjugationshyphen unterliegt die weitere Entwicklung der Kontrolle des b-Locus. Die Expression des durch den b-Locus kodierten heterodimeren Transkriptionsfaktors bE/bW ist notwendig für die Aufrechterhaltung des Zellzyklusarrestes und des filamentösen Wachstums. In vorangegangenen Studien konnten 345 b-regulierte Gene identifiziert werden, von denen mehr als 90% in Abhängigkeit des C2H2-Zinkfinger Transkriptionsfaktors Rbf1 reguliert werden. Neben diesem „Master-Regulator“ der pathogenen Entwicklung ist clp1 das einzige direkt b-regulierte Gen, das ebenfalls für die pathogene Entwicklung von U. maydis notwendig ist und unabhängig von Rbf1 exprimiert wird. Delta-clp1 Stämme sind nicht in der Lage Schnallenzellen zu bilden und innerhalb der Pflanze zu wachsen, was eine mögliche Funktion in der Regulation dieser Entwicklungsprozesse vermuten ließ. Die induzierte Co-Expression von clp1 führt zur Inhibition der Funktion des b-Heterodimers, wodurch filamentöses Wachstum und der G2-Zellzyklusarrest verhindert werden (Scherer et al., 2006; Scherer, unveröffentlicht). In vorangegangenen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass Clp1 unter anderem mit dem bW-Protein und Rbf1, den zentralen Regulatoren der pathogenen Entwicklung interagiert. In der vorliegenden Studie wurden die funktionellen Auswirkungen der Clp1-Protein-Interaktion auf die pathogene Entwicklung von U. maydis untersucht. Die Interaktion von Clp1 mit bW führt zu einem generellen Funktionsverlust des b-Heterodimeres und, daraus resultierend, zur globalen Repression der b-abhängigen Genregulation. Die Interaktion von Clp1 mit Rbf1 hingegen führt zu einer spezifischen Repression des Pheromongens mfa, wodurch die Pheromonantwort sowohl auf morphologischer als auch auf regulatorischer Ebene unterdrückt wird. Die weitere Charakterisierung von Clp1-interagierenden Proteinen führte zur Identifizierung des Transkriptionsfaktors Cib1. Die Deletion von cib1 führt zu einer Phänokopie der clp1 Deletion. Ähnlich wie bei Clp1 ist die Proteinexpression von Cib1 posttranskriptionell reguliert und auf postpenetrative Entwicklungsstadien begrenzt. Im Gegensatz zu Clp1 konnte der Mechanismus der posttranskriptionellen Regulation von Cib1 aufgeklärt und auf entwicklungsspezifisch reguliertes alternatives Spleißen zurückgeführt werden. Clp1 fungiert als Modulator von zwei Transkriptionsfaktoren, die beide eine zentrale Rolle bei der Steuerung des pathogenen Wachstums, aber auch bei der Zellzyklus-Kontrolle haben. Sowohl Rbf1 als auch das b-Heterodimer induzieren einen G2-Zellzyklusarrest, der erst nach der Penetration der Pflanzenoberfläche aufgehoben wird. Die Funktion des b-Heterodimeres, und vermutlich auch die von Rbf1, ist während der gesamten pathogenen Entwicklung notwendig. Die Funktion von Clp1 ist es, durch die Interaktion mit bW und Rbf1 die Re-Initiation des Zellzyklus zu ermöglichen. Durch die Verwendung eines artifiziellen Promotorsystems, das die Expression von rbf1 während und nach der Penetration der Pflanzenoberfläche gewährleistet, wurde erstmalig die Bildung von Appressorien und die darauffolgende Penetration der Pflanzenoberfläche unabhängig von einem aktiven b-Heterodimer nachgewiesen. Die durch Rbf1 regulierten Gene sind damit für die initialen Infektionsprozesse ausreichend. Die Re-Initiation des Zellzyklus und eine begrenzte Proliferation in planta werden allerdings erst durch die zusätzliche Expression von Clp1 ermöglicht. Im weiteren Verlauf der Infektion kommt es dann zu asynchronen Kernteilungen und Pflanzenabwehrreaktionen. Für die Unterdrückung von Pflanzenabwehrreaktionen und eine koordinierte synchrone Entwicklung in planta ist offensichtlich die Funktion des b-Heterodimeres entscheidend. Durch diesen Ansatz wurden neue Einblicke und ein grundlegendes Verständnis der regulatorischen Wechselwirkungen innerhalb der verschiedenen Signalwege und deren Auswirkung auf die biotrophe Entwicklung von U. maydis erlangt